外泌体绿色荧光标记染料（PKH67）

Exosome Green Fluorescent labeling dye（PKH67）

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产品简介：

PKH67 是适用于体外及体内细胞示踪的绿色亲脂细胞膜染料。染料通过长脂肪链锚定于细胞膜脂质层；配套 Diluent C 水性溶剂可维持细胞活力，并提升染料溶解性与标记效率。

PKH67 发射绿色荧光，相较于 PKH2 拥有更长碳链，可减少细胞间染料交叉转移。该染料细胞毒性低、背景荧光弱、荧光信号稳定，生理 pH 范围内荧光性质不受酸碱度影响。

PKH67 可与 PI、7-AAD 联合用于细胞活力与毒性检测，亦可与 PE、红色荧光蛋白等橙红色荧光探针搭配开展多色分析。基于染料稀释效应，该染料常用于细胞增殖研究，同时支持细胞迁移、吞噬、抗原呈递、外泌体 / 脂质体摄取、膜转运等体外实验以及体内细胞示踪。

体外染料滞留特征与体内非分裂细胞荧光衰减规律具有相关性，PKH67 体内荧光半衰期约 10–12 d，适合短期至中期绿色荧光标记的体内示踪及多种体外细胞功能研究。

产品组成：

荧光波长：λ_ex 490 nm；λ_em 502 nm

保存条件: 

2-8℃避光（一年有效）

产品使用：

一、        外泌体染色

1.     外泌体蛋白定量：

取适量外泌体样本，采用 BCA 法测定蛋白浓度，确定外泌体蛋白总量。

2.     染料工作液制备：

使用 Diluent C 将 PKH67 linker（for green fluorescent cell labeling）稀释 10 倍，配制成 100 μM 染料工作液；全程避光操作，工作液按需配制、现配现用。

3.     外泌体染色：

1)     向外泌体样本中加入染料工作液，推荐参考下述加样剂量：

2)     添加染料工作液后拧紧离心管管盖，涡旋振荡混匀 1 min，随后静置孵育 10 min。

3)     向孵育完成的外泌体 - 染料混合体系中加入 10 mL 1×PBS 并充分混匀。

4)     参照原有外泌体提取流程再次纯化外泌体，除去体系中游离多余染料。

5)     使用 200 μL 1×PBS 重悬沉淀，所得沉淀即为染色完成的外泌体。

注：染色剂量过高会破坏外泌体膜完整性；最优 PKH67 染料与外泌体配比需依据各自实验条件摸索确定。

二、        细胞膜标记

下述标记方案采用 2 mL 终染色体系，体系终浓度：PKH67 2 μM，细胞密度 1×10⁷ 个 /mL，适用于干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经元及其他多种细胞的体外 / 离体标记，满足染料嵌入细胞膜脂质区域的实验需求。开展体内标记、血小板或吞噬细胞标记时，可能需要调整实验方案。使用者需结合自身实验所用细胞类型与研究目的，预实验摸索最优染料浓度与细胞工作浓度；评估指标包括染色后细胞活力（如碘化丙啶排斥实验）、荧光强度、染色均一性，同时需验证染料标记不会对目标细胞功能产生干扰。

1.     取含 2×10⁷ 个单细胞的细胞悬液，转移至无菌聚丙烯尖底离心管中，采用无血清培养基进行单次洗涤。

2.     将细胞样本于 400×g 条件下离心 5 min，制备松散细胞沉淀。

3.     离心结束后轻柔吸除上清液，操作过程中避免吸取细胞，控制管内残留上清体积不超过 25 μL。为保障实验重复性，将细胞重悬于 Diluent C 稀释液时，需尽量减少管内残留培养基或缓冲液体积。

4.     配制2×细胞悬液：向细胞沉淀中加入 1 mL Diluent C，轻柔吹打充分重悬细胞。全程禁止涡旋振荡，且细胞不可长时间置于 Diluent C中静置。

5.     染色现配2×染料工作液（4 μM）：吸取 4 μL PKH67原液，加入盛有 1 mL Diluent C的聚丙烯离心管中，充分混匀至体系均匀。

注：为最大限度降低乙醇对细胞活性的影响，步骤 5 的染料添加体积需严格控制，使步骤 6 混匀后体系内乙醇终浓度不超过 1%–2%。若实验所需染料终浓度低于 2 μM，为保证实验结果稳定、重复性良好，可采用无水乙醇对 PKH67 原液进行稀释，提前配制梯度中间储存液备用。

6.     取 1 mL 步骤4制备的2×细胞悬液，快速加入 1 mL 步骤5配制的2×染料工作液中，立即吹打混匀样本。混匀后体系终浓度为：细胞 1×10⁷ 个/mL、PKH67 2 μM。

7.     将配制完成的细胞-染料混合悬液于室温条件下孵育 1–5 min，期间间断混匀。本染色反应速率极快，延长孵育时间无法提升标记效果。

8.     加入等体积（2 mL）血清或 1% BSA 等适宜蛋白溶液终止染色反应，静置孵育 1 min，充分结合体系内游离的多余染料。

9.     在 20–25 ℃室温环境下，400×g 离心 10 min，轻柔吸弃上清，防止丢失细胞。将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基后，转移至全新无菌聚丙烯尖底离心管；于相同温度与离心条件下离心 5 min，更换 10 mL 完全培养基重复洗涤沉淀2次，彻底去除残留游离染料。

10.   末次洗涤结束后，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基，检测细胞回收率、细胞活力及荧光强度。根据实验需求再次离心，将细胞重悬至适宜的活细胞终浓度即可。标记后的细胞可采用 1%–2% 中性缓冲甲醛（中性福尔马林）进行固定；样品避光保存条件下，荧光信号可稳定维持至少 3 周。

三、        组织病理学检测

针对亲脂性膜染料标记细胞的组织样本，组织学检测常采用连续冰冻切片；也可使用 4% 多聚甲醛（货号NBS0135）固定样本后制备切片。上述方式能够避免病理复染试剂引发的荧光淬灭。若需在同一组织切片上先后开展荧光成像与复染，应先完成荧光显微拍摄，再进行复染操作。

1.     冰冻切片荧光成像

1)     取出待切片检测的组织样本，立即置于干冰中快速速冻。

2)     速冻后的组织样本置于 −70 ℃环境冷冻保存，待后续切片使用。

3)     采用O.C.T.包埋剂或等效冰冻包埋材料，对冷冻组织进行包埋处理。

4)     对包埋完成的组织进行冰冻切片制备。

5)     将制备好的组织切片置于室温条件下自然风干，风干时长不少于1 h。

6)     于切片上滴加1–2滴氰基丙烯酸酯胶水完成封片操作。

7)     选用适配的滤光片体系进行切片观察与图像采集，PKH67荧光信号可使用FITC通道检测成像。

2.     冰冻切片复染流程

1)     将载玻片浸泡于丙酮中 24–48 h，分离取下盖玻片。

2)     采用蒸馏水充分漂洗载玻片，洗净残留丙酮。

3)     选择适宜染料开展切片复染；迈尔苏木素、哈里斯苏木素均能取得良好染色效果。

4)     采用 Fluoromount-G 抗荧光淬灭封片剂（货号NBS0032）或等效产品进行封片，该封片剂可缓解荧光光漂白，实现半永久封固。封片后的切片置于 2–8 ℃避光保存，适合短期成像及数周内样本存放。

注意事项：

1.     PKH67 原液易水解失活，建议分装后以封口膜密封避光保存；染色工作液需现配现用，不可提前制备，否则会显著降低标记效率。

2.     PKH67 稀释液低温环境下易凝固附着于管底，使用前可于 37 ℃水浴短暂加热，待完全融解混匀后再进行实验。

3.     PKH67 染色体系中严禁加入叠氮化物或代谢抑制剂，避免干扰膜染料标记反应。

4.     贴壁细胞可原位直接标记，但单细胞悬液标记均匀性更佳。贴壁细胞或易聚团细胞建议经胰酶 - EDTA 消化制备单细胞悬液后再染色，以获得稳定均一的标记效果。

5.     针对外泌体标记实验，推荐外泌体原液初始浓度为 0.5~1 μg/μL，浓度过低会大幅增加实验失败风险。

6.     外泌体染色后必须彻底去除游离染料，该步骤属于二次纯化过程，适用于所有外泌体纯化方式，可有效避免残留游离染料干扰后续细胞孵育与功能实验。

7.     外泌体 - 细胞共孵育阶段建议采用无血清体系，可显著提升细胞对外泌体的摄取效率，参考孵育时长为 2~24 h。

8.     由于外泌体标记效率无法达到 100%，且除游离染料过程存在样本损耗，建议标记时投入2 倍实验需求量的外泌体，保障后续实验用量充足。

9.     为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

使用本产品发表的文献：

1.     Yao Z, Meng Y, Li H, Jiang Y, Lin X, Hu M, et al. Mitigating Cancer Therapy-Related Cognitive Impairment by Targeted Activation of Undruggable Phosphatase. Adv Sci (Weinh) [Internet]. 2026 Jul 28;e20135. doi:10.1002/advs.202520135. Available from:

The PKH67 green fluorescent cell ligation kit (NoninBio) was used to label the lipid bilayer of exosomes.

2.     Xue J, Ye J, Han P, Song Y. Synovial Mesenchymal Stem Cell–Derived Exosomal miR‐3614‐5p Regulates Macrophage Polarization by Targeting ANXA2 to Relieve Knee Osteoarthritis. The Journal of Gene Medicine. 2025 Dec;27(12):e70064. Available from:

To investigate whether SMSC- Exos can be internalized by macrophages, this study labeled SMSCs with PKH67 fluorescent lipophilic dye (Nonin BioTech, Shanghai, China).

3.     Ni X, Lv Y, Han L, Wang Q, Wang J, Liu T, et al. Exosomal miR‑107 Derived From Cigarette Smoking‑Exposed Bronchial Epithelial Cells Aggravates Acute Lung Injury by Polarizing Macrophage to Proinflammatory Phenotype. J Biochem Mol Toxicol [Internet]. 2025 Feb;39(2):e70139. doi:10.1002/jbt.70139. Available from:

Exosomes derived from BEAS‐2B cells were labeled with an Exosome Green Fluorescent Label Kit (NoninBio, Shanghai, China) following the manufacturer's protocol.

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